核酸检测试剂盒：缉拿新型冠状病毒的“神探”

作者丨云南农业大学教授 董扬

文字整理丨科技日报记者 赵汉斌

疾病的检测和甄别对于治疗至关重要，新型冠状病毒导致的肺炎曾被当作普通流感治疗。同样的疾病，反映在不同患者上会有不同的症状；同样的症状，也有可能是不同的疾病。面对传染性疾病，首先是要搞清楚它的传染源。

病毒核酸检测是一种从基因水平进行筛查检测的方法，相较于血清学检测，有更高的特异性和灵敏性，它可检测出标本中极低含量的病毒，并大大缩短了病毒检测“窗口期”。

试剂盒长什么样？是如何“工作”的？我们熟知的检测试纸又利用了什么原理？在这里跟大家聊一聊。

我们的生活依赖肉眼看不见的微生物

直到今天，我们对微生物的了解还是极其有限的。在微生物的世界中，我们有如懵懂的孩童在管中窥豹，所看到的，只是冰山一角。在十七世纪显微镜逐渐成形后，人类终于可以看到微生物了，但是对于致病微生物的发现，一直以来都困难重重。

列文虎克和他的显微镜（约1860年）

在人体中，天然存在大量的微生物，其中以肠道中的微生物数量最多，种群最为丰富。每个人肠道中大约有两千克的微生物，大约80%的人体正常微生物都集中在这里，它们的数量超过100万亿个（这个数字大约是人体细胞总数的十倍），种类多达四五百种。

我们的皮肤、汗液，甚至健康人的尿液中都有微生物天然存在，这些微生物大多数都是益生菌，和我们的身体和谐相处，甚至为我们提供很多帮助。

我们生活的环境中也充满了微生物，土壤、空气、水源无处不在，所以要发现致病微生物非常困难，需要精准区别致病微生物和环境微生物、益生菌，无异于徒手大海捞针。

人体中大肠的微生物菌丛数量最多。图片来源：Abundant You

古希腊医学认为，人体是由四种体液构成，即血液、黏液、黄胆汁和黑胆汁，这四种体液对应到四种元素、四种气质，并认为四种体液在人体内失去平衡就会造成疾病，又称为四体液学说、四体液说，这一观点主导了欧洲长达2200年。现代医学发端以来，欧洲的医学一只围绕着四种液体进行。

所以，显微镜发明以后，医生们也自然而然地将目光锁定在血液上，并很快意识到，正常人的血液是无菌的。通过用显微镜检测血液中是否有微生物，人类发现了败血症的原因；通过检测体液，人类发现了霍乱的致病菌。很长一段的好时间，我们的病原微生物发现都采取“观察看见——分类培养——接种动物实验确认”的方式来进行。一路下来，成果也着实惊人——

核酸的生命基础观念开启了新时代

现代传染病研究是建立在病原微生物的发现基础上的，快速鉴别病原，甚至是一些很难分离和培养的病原微生物，能在不需要培养的情况下就精确鉴定，是每一个传染病研究和治疗中最关键的技术。

1953年，DNA双螺旋结构被揭示，核酸是生命的基础这样的观点开启了新的时代，人们设想对于病原微生物检测，只需要确定病原体的核酸序列，就可以知道是否有病原体是生命病原体。可是要实现核酸的检测，却非常困难，一个成年人的细胞中，也仅有3皮克DNA（1皮克为万亿分之一克），必须要通过实验方法放大检测。

美国化学家凯利·穆利斯（资料图）

1983年，放荡不羁、喜欢奇思妙想的美国化学家凯利·穆利斯（Kary Mullis），在从伯克利开车去门多西诺的飙车途中，在一条黑暗的路上 “灵光一闪解决了DNA化学中最令人头疼的问题”，发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，并于1985年提交专利，从此人们开始在试管里大量复制任何DNA片段，整个生命科学和医学检验学从此被划分为PCR之前时代和PCR之后时代。穆利斯也因此于1993年和迈克尔·史密斯（(Michael Smith）分享了诺贝尔化学奖，同年还获得日本国际奖。

聚合酶链式反应（PCR）技术示意图

从此，使得人类在体外检测病原体的DNA变成了现实，这种无需培养，甚至不需要分离病原体的方法，成为病原诊断领域发展最迅速的技术，很快成为主流检测方法，并且很影响到食品微生物检测、环境微生物监测和法医领域，我们熟知的神探李昌钰，早年就是以利用DNA检测技术来破获一系列答案，相享誉侦探界。

早在19世纪80年代半期，学者们在研究病原菌的过程中，已在感染者的血清中发现有“杀菌素”(bactericidins)，也就是最早发现的抗体。当时的科学家们根据抗体来源的特性，把能刺激宿主产生抗体的物质命名为抗原。到了1963年，埃德尔曼（Edelman）与罗德尼·罗伯特·波特（Rodney Robert Porter）结合两人多年的研究结果，提出了比较成熟的抗体分子模型，而波特也是桑格（Sanger）的第一名博士研究生。

他们认为，抗体是由两条重链和两条轻链组成的“Y”型对称结构，“Y”的头部是用来识别抗原的。1976年，日本科学家利根川进和同事发现人体中可以通过基因重排，产生数百亿种不同的抗体，很好地解释了抗体可以特异识别抗原的原理。1975年英国科学家米尔斯坦（Milstein）和法国科学家科勒（Kohler）发明了单克隆抗体制备技术。这样人们就可以大量获得特异性很高、纯度很高的抗体，并且利用这些抗体的特异性实现对病原微生物的检测，而且这种抗元-抗体反应非常迅速，并且可以实现化学试剂和抗体结合，让检测结果通过颜色反应肉眼可见，于是，就有了我们熟知的检测试纸条。

人类离甄别“害人精”病毒的时代已经越来越近了。

识别病毒的“神探”真的来了

如此前我们在科普文章所述，病毒是一种个体微小、结构简单，只含一种核酸（DNA或RNA），必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。它由一个核酸长链和蛋白质外壳构成，却没有自己的代谢机构，也没有酶系统。因此病毒离开了宿主细胞，就成了没有任何生命活动、也不能独立自我繁殖的化学物质。但一旦进入宿主细胞后，它就可以利用细胞中的物质和能量以及复制、转录和转译的能力，按照它自己的核酸所包含的遗传信息，产生和它一样的新一代病毒。

病毒比细菌小很多，又是寄生在细胞内，致病病毒的检测要远比致病细菌检测难很多，病毒的培养也要远远比细菌培养难，如果依靠传统的检测方法，我们依然很难发现并追踪病毒，这个人类杀手将变得更加肆无忌惮。

PCR八联管。图片来源：Wikipedia

幸好有了历代科学家的积累和发现，人类掌握了核酸检测技术和抗体检测技术。以本次新型冠状病毒检测为案例，目前我们可以用的成熟的检测试剂盒有两种：

基于荧光定量PCR检测技术的试剂盒，如华大基因捐赠的试剂盒等，这些试剂盒是目前主流的检测试剂盒。由于冠状病毒无论是寄生状态还是游离状态，它都需要有遗传物质，也就是它自己的RNA，RNA可以通过反转录酶变成DNA，之后再通过聚合酶链式反应（PCR）实现指数级的信号扩增放大，在扩展放大过程中，加入荧光基团结合在扩展产物上，检测的时候用仪器读取荧光值，不但可以实现定性检测，判断病毒有无，还可以实现初步的定量检测，判断病毒数量多少。这种检测方法非常精准，特异性和灵敏度都非常高。

基于抗体检测技术，这类检测试剂盒一般被制备成为试纸条，试纸条上化学修饰过的针对新型冠状病毒抗体，在遇到待检测体液中的病毒，会快速发生“抗体-抗原”反应，出现不同的颜色，整个检测时间可以控制在15分钟内，结果肉眼可视，这种检测可以实现即时检测（POCT），但是准确性略差，特别是在病毒潜伏期，病毒浓度和数量都较少的时候，容易漏筛。

国家病原微生物资源库于2020年1月24日发布了由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所成功分离的我国第一株病毒毒种信息及其电镜照片、新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列等国内首次发布的重要权威信息，并提供共享服务。（图片来源：中国疾病预防控制中心）

揭示新型冠状病毒的几个重要节点

2019年12月30日

研究人员通过对武汉金银潭医院3名肺炎患者的样本进行全基因组测序，发现了一种从未见过的乙型冠状病毒属（beta coronavirus）病毒。

2020年1月6日

新型冠状病毒从感染者气道上皮细胞中分离出，随后将其命名为2019-nCoV。为了明确新型冠状病毒感染的人呼吸道上皮细胞内可否观察到病毒颗粒，研究人员模拟新型冠状病毒感染的人类呼吸道上皮细胞培养物，每天用光学显微镜进行观察，培养6天后用透射电镜观察。研究发现，在人呼吸道上皮细胞表面接种96小时可以观察到细胞病变，成功地观察和检测到了新型冠状病毒。

2020年1月24日

国家病原微生物资源库发布了由中国疾病预防控制中心成功分离的我国第一株新型冠状病毒电镜照片。

2020年1月25日

多家企业宣布成功研发基于荧光定量PCR的新型冠状病毒检测试剂盒，并且快速捐赠和通过审批。

2020年1月27日

国家病原微生物资源库再次发布了由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所成功分离的我国第一株从环境样本中分离的新型冠状病毒毒种中英文名称、编号（NPRC 2020.00002）信息及其电镜照片、新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列等全球首次发布的重要权威信息。同日，华大基因选择国产测序仪通过审批用于新型冠状病毒检测。

2020年1月28日

据中科院之声消息，中国科学院武汉病毒研究所研制出了用于研究的抗体检测试纸。

研究人员在进行新型冠状病毒毒株分离实验。图片来源：浙江新闻客户端

也就是说，1月6日完成病毒测序后，新型冠状病毒的检测发生了转折性的变化。通过测序技术所获得病毒的基因组信息，同时分离病毒，现代的检测技术让病毒一旦被锁定就无处可遁。和SARS相比，这次中国的速度令世界瞩目。此外，基于CRISPR-cas、Meta-genomics测序的更先进的检测技术也可以完全实现新型冠状病毒的检测，在面对隐形杀手病毒的时候，这次我们不再是一脸茫然，有这些病毒检测技术、DNA测序和序列分析技术、大数据病原溯源体系，定然可以实现对病毒的精准打击与歼灭！

最后，我们想告诉大家的是，从目前的情况看，综合全国检测试剂盒的产能，可以覆盖至少每日50万人次的检测，按照人均5次的反复确认检测，我们每天可以完成10万人的检测。当然，这些检测很多都需要技术熟练的专业检验师和科研人员操作；而操作的第一步，就是接触患者或受检人的痰液、粪便或者血液，这个过程有很大的被感染的风险，因此一定需要在有对应防控级别的实验室中操作，这些检验人员也暴露在很大的风险中。虽然有些企业也提出了一些可以代替手工检测的实验室自动化解决方案，但是仪器设备的部署、人员的培训都需要时间。所以，也需要全社会给这些检验人员一些时间，他们也是在用生命捍卫生命！

华大基因的创始人汪建老师提出，“建设万人级别的检测中心”是对目前检测的最好解决方法，集中检测不但效率更高，还可避免病毒在检测环节的二次传染。

面对新型冠状病毒，我们有中国速度、世界科技和人类智慧，这次，真的不用怕。